該研究于2025年3月發(fā)表在《Veterinary Dermatology》期刊，由岡山理科大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的Akira Matsuda研究團隊完成。研究內(nèi)容為驗證臭氧水的抗菌特性及其對犬皮膚屏障功能的影響，通過與純凈水、0.005%次氯酸鈉、0.05%次氯酸鈉的對比實驗，評估臭氧水作為犬皮膚消毒劑的安全性和有效性，同時探究其對犬表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（CPEK）增殖的影響。

摘要

背景：近年來，從防止抗生素耐藥菌傳播的角度考慮，使用消毒劑治療犬細(xì)菌性皮膚病引起了人們的關(guān)注。臭氧水是一種兼具高抗菌效果和安全性的消毒劑，但目前尚無報道證實其對犬皮膚屏障功能的影響。

目的：本研究旨在驗證臭氧水的抗菌特性及其對犬皮膚屏障功能的影響。

動物：抗菌試驗用4只比格犬，屏障功能試驗用6只比格犬。

材料與方法：使用純凈水、3mg/L臭氧水、0.005%和0.05%次氯酸鈉作為試驗產(chǎn)品。每次使用后5分鐘收集皮膚細(xì)菌并進行培養(yǎng)以測量細(xì)菌數(shù)量。使用前和使用后每天測量一次經(jīng)表皮水分流失（TEWL）和皮膚表面水分（SSH），持續(xù)2周。此外，在與測試產(chǎn)品孵育5分鐘后檢查了犬表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（CPEK）的增殖情況。

結(jié)果：臭氧水和0.05%次氯酸鈉明顯減少了皮膚細(xì)菌數(shù)量。所有測試產(chǎn)品均未惡化TEWL和SSH值。次氯酸鈉抑制了CPEK的增殖，而臭氧水則沒有。

結(jié)論：臭氧水對犬皮膚的抗菌作用與0.05%次氯酸鈉相當(dāng)，但不抑制體外角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。因此，臭氧水有可能用作犬皮膚的安全有效消毒劑。

實驗材料與儀器

實驗材料

1. 測試產(chǎn)品：純凈水、3mg/L臭氧水、0.005%次氯酸鈉、0.05%次氯酸鈉。

2. 實驗動物：4只健康雄性比格犬（2歲，體重10.32-10.83kg，用于抗菌試驗）；6只健康比格犬（1只雄性、5只雌性，2歲，體重9.16-11.36kg，用于屏障功能試驗）。

3. 細(xì)胞與培養(yǎng)基：犬表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、CnT-09培養(yǎng)基。

4. 試劑：D/E中和肉湯、D/E中和瓊脂、磷酸緩沖鹽溶液、Cell Counting Kit-8。

實驗儀器

1. 臭氧水生成設(shè)備：aquray臭氧水生產(chǎn)噴霧。

2. 樣本采集與處理儀器：電動剃須刀、無菌棉簽、無菌試管、96孔板。

3. 檢測儀器：ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、MoistureMeterSC、CO?培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀。

4. 統(tǒng)計軟件：EZR、G*Power [3.1.9.7](3.1.9.7)。

實驗過程

動物預(yù)處理

實驗前通過血液學(xué)和生化檢查確認(rèn)動物無異常，實驗前1個月內(nèi)未給予任何藥物，實驗前2周內(nèi)未進行沐浴或除測試產(chǎn)品外的局部涂抹。

單次應(yīng)用抗菌實驗

1. 實驗前1天，用電動剃須刀在犬背部剃除4個3×3cm的區(qū)域（每側(cè)對稱2個）。

2. 實驗當(dāng)天，按0.2mL/cm2的劑量向剃毛區(qū)域分別噴灑純凈水、3mg/L臭氧水、0.005%次氯酸鈉和0.05%次氯酸鈉。

3. 噴灑后5分鐘，用浸潤D/E中和肉湯的無菌棉簽在每個區(qū)域垂直和水平輕拭5次采集皮膚細(xì)菌，將棉簽放入含10mL D/E中和肉湯的無菌試管中混合，冰浴運輸至實驗室。

4. 取100μL混合液接種到D/E中和瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)48小時后計數(shù)菌落數(shù)。

重復(fù)應(yīng)用皮膚屏障影響實驗

1. 實驗前1天，在犬背部剃除6個3×3cm的區(qū)域（每側(cè)對稱3個）。

2. 實驗第1天，觀測臨床癥狀并使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀測量TEWL（經(jīng)表皮水分）、MoistureMeterSC測量SSH，選擇4個指標(biāo)差異最小的區(qū)域，按0.2mL/cm2噴灑上述4種測試產(chǎn)品。

3. 

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

消毒劑反復(fù)涂抹 2 周前后的皮膚屏障功能指標(biāo)

選取 6 只比格犬，在其背部剃毛區(qū)域每日涂抹純凈水、臭氧水及兩種濃度的次氯酸鈉（0.005% 和 0.05%）各一次。于末次涂抹 24 小時后，檢測經(jīng)表皮失水量（TEWL）（圖 a）與皮膚表面含水量（SSH）（圖 b）。

3. 此后每天噴灑1次，持續(xù)2周，次噴灑后24小時再次觀測臨床癥狀并測量TEWL和SSH。

4. 臨床癥狀按紅斑、丘疹、鱗屑和苔蘚化評分（0=無臨床癥狀；1=輕度；2=中度；3=重度），TEWL測量前將犬置于25±2℃、濕度55±5%的房間靜置20分鐘，TEWL和SSH均在同一位置測量3次，取平均值，所有觀測和測量由不知情測試產(chǎn)品分組的人員完成。

細(xì)胞毒性測定

1. 將CPEK以4×10?個細(xì)胞/100μL/孔的密度接種到96孔板，在37℃、5% CO?條件下培養(yǎng)24小時。

2. 移除培養(yǎng)基，用PBS清洗后，向每孔加入100μL測試產(chǎn)品，在相同培養(yǎng)條件下孵育5分鐘。

3. 移除上清液，用PBS清洗2次，加入100μL CnT-09培養(yǎng)基，分別在0、24、48、72、96小時進行培養(yǎng)。

4. 每孔加入WST-8試劑，37℃、5% CO?孵育30分鐘后，用酶標(biāo)儀測量450nm處吸光度，實驗獨立重復(fù)3次。

統(tǒng)計分析

采用Kolmogorov-Smirnov檢驗驗證正態(tài)性，Bartlett檢驗驗證方差同質(zhì)性，細(xì)菌計數(shù)采用ANOVA后進行Tukey誠實顯著差異檢驗；TEWL和SSH采用Kruskal-Wallis檢驗后進行Steel-Dwass檢驗，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

實驗結(jié)論

1. 抗菌效果：3mg/L臭氧水和0.05%次氯酸鈉能明顯減少犬皮膚細(xì)菌數(shù)量，0.005%次氯酸鈉雖有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，臭氧水的抗菌活性與0.05%次氯酸鈉相當(dāng)，且高于0.005%次氯酸鈉。

2. 皮膚屏障影響：所有測試產(chǎn)品均未惡化TEWL和SSH值，重復(fù)應(yīng)用2周后，臭氧水和0.05%次氯酸鈉組的SSH有升高趨勢，提示可能有助于增強犬皮膚屏障功能，且所有組均未出現(xiàn)明顯臨床癥狀（評分多為0分，少數(shù)為1分，無2分及以上情況）。

3. 細(xì)胞毒性：0.005%和0.05%次氯酸鈉孵育5分鐘后抑制CPEK增殖，而臭氧水孵育后CPEK的增殖情況與純凈水組相似，72小時后達到匯合狀態(tài)，表明臭氧水對犬表皮角質(zhì)形成細(xì)胞幾乎無細(xì)胞毒性。