文獻(xiàn)分享 | IVPT離體皮膚屏障針頭穿刺破壞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中經(jīng)皮水分流失值變化靈敏度測(cè)試研究

引言

Eman Elmahjoubi團(tuán)隊(duì)與紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)合作在《Toxicology in Vitro》發(fā)表研究，采用Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀，系統(tǒng)驗(yàn)證了經(jīng)表皮水分流失（TEWL）法評(píng)估體外全層豬皮屏障功能的有效性，為皮膚毒性檢測(cè)與屏障功能評(píng)估提供了高效替代方案。

摘要

皮膚屏障功能是開展體外經(jīng)皮吸收研究時(shí)需考量的關(guān)鍵參數(shù)。盡管氚水通量測(cè)量常被用于評(píng)估皮膚完整性，但近幾十年來，更快速、易用的經(jīng)表皮水分流失（TEWL）法已逐漸興起。然而，迄今為止，TEWL與體外皮膚屏障功能之間的相關(guān)性尚未得到全面明確。本研究采用一款基于冷誘導(dǎo)蒸汽阱原理的新型 TEWL儀器，對(duì)全層豬皮的屏障功能進(jìn)行探測(cè)。該方法靈敏度足以體現(xiàn)穿刺對(duì)屏障功能的影響，不過觀察到的非線性模式提示，可能存在組織腫脹過程和/或毛細(xì)作用。多項(xiàng)表面活性劑暴露實(shí)驗(yàn)的結(jié)果充分表明，TEWL 確實(shí)在很大程度上可預(yù)測(cè)皮膚樣品的完整性。核心研究發(fā)現(xiàn)為：基礎(chǔ) TEWL 與基礎(chǔ)氚水通量呈線性相關(guān)）。因此，專用 TEWL 法可作為氚水通量測(cè)量的優(yōu)良替代方案，用于評(píng)估全層皮膚屏障功能。

研究背景與目的

1.       皮膚屏障功能評(píng)估的重要性：在體外經(jīng)皮吸收研究中，皮膚樣本質(zhì)量控制至關(guān)重要，如 OECD 428 測(cè)試指南要求排除受損皮膚樣本。傳統(tǒng)評(píng)估方法（如氚水通量測(cè)量）存在局限性，包括無法用于氚標(biāo)記測(cè)試化合物、會(huì)水合角質(zhì)層、耗時(shí)且需放射性物質(zhì)監(jiān)管審批。

2.       替代方法的爭議：近幾十年，經(jīng)皮電阻測(cè)量和 TEWL 評(píng)估成為氚水通量測(cè)量的替代方案。但 TEWL 與體外皮膚屏障功能的相關(guān)性尚未明確，不同研究團(tuán)隊(duì)因皮膚模型、方法和 TEWL 測(cè)量儀器的不同，得出的結(jié)果存在沖突。

3.       研究目的：使用新型Biox AquaFlux經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀進(jìn)一步探究 TEWL 與氚水通量的關(guān)系，驗(yàn)證 TEWL 方法評(píng)估體外全層豬皮膚屏障功能的有效性，具體包括：

?       研究基礎(chǔ) TEWL 速率與基礎(chǔ)氚水通量的關(guān)系；

?       考察穿刺針孔數(shù)量對(duì)經(jīng)皮水分流失值的影響，判斷TEWL 方法能否區(qū)分不同穿刺數(shù)量；

?       研究表面活性劑（尤其是陰離子表面活性劑）對(duì)皮膚屏障功能的影響，包括表面活性劑鏈長、十二烷基硫酸鈉（SLS）的濃度、體積和接觸時(shí)間的作用。

材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

2.       化學(xué)試劑：氚水（1mCi/ml）、閃爍液、各類陰離子表面活性劑（SLS、辛基硫酸鈉（SOS）、癸基硫酸鈉（SDS）、十四烷基硫酸鈉（STDS）、二十烷基硫酸鈉（SES））、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH7.4）等，均購自特定供應(yīng)商，實(shí)驗(yàn)全程使用雙蒸去離子水。

3.       皮膚樣本：選用長白豬耳朵，來自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)，屠宰后立即采集，不進(jìn)行蒸汽滅菌。清洗后切成約 8cm2 的完整皮膚樣本，無可見缺陷的樣本用鋁箔包裹，在-80℃下儲(chǔ)存不超過 6 個(gè)月，使用前室溫解凍并切成適合安裝在擴(kuò)散池上的小塊。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

穿刺皮膚樣本的 TEWL 測(cè)量：用 2.5cm 長的 PrecisionGlide 針頭在全層皮膚樣本上穿刺，穿刺位置靠近擴(kuò)散區(qū)域中心且貫穿組織全層，穿刺數(shù)量分別為 0（對(duì)照）、1、2、3、4、5、6、7 個(gè)。將穿刺后的皮膚作為屏障膜，接收室含 PBS（pH7.4）的 Franz 池中，皮膚表面保持干燥，插入帶專用供給池耦合器的 Aquaflux 測(cè)量探頭，按上述方法測(cè)量 TEWL，每個(gè)穿刺實(shí)驗(yàn)重復(fù) 4 次，穿刺后 10-15 分鐘開始 TEWL 測(cè)量。

研究數(shù)據(jù)

皮膚穿刺次數(shù)對(duì) TEWL 的影響：單個(gè)穿刺使皮膚水分流失量比完整皮膚顯著增加約 50%，但 2、3、4 個(gè)穿刺孔并未導(dǎo)致 TEWL 進(jìn)一步顯著變化；當(dāng)穿刺數(shù)量為 5 個(gè)時(shí)，TEWL 出現(xiàn)進(jìn)一步大幅增加，且在 6、7 個(gè)穿刺孔時(shí)，TEWL 值維持在該升高水平。各穿刺組（除對(duì)照）的 TEWL 值相互間無顯著差異，但均與未穿刺皮膚的 TEWL 值有顯著差異。

（Biox Aquaflux經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀）

結(jié)論

本研究體外穿刺數(shù)據(jù)與其他研究存在差異。Chilcott 等人（2002）用開放室儀器（Evaporimeter）發(fā)現(xiàn)穿刺后 1 小時(shí)，TEWL 大小與穿刺孔數(shù)量成正比；Netzlaff 等人（2006）用 Tewameter 發(fā)現(xiàn)僅能區(qū)分完整和單孔穿刺的聚四氟乙烯膜，穿刺孔從 1 增加到 5 時(shí) TEWL 不再升高，且穿刺對(duì)人表皮膜 TEWL 讀數(shù)無影響。本研究得到的 “階梯式" 模式介于兩者之間?？赡茉虬ǎ航邮找嚎赡芡ㄟ^孔被吸到皮膚表面形成水膜；穿刺孔可能因皮膚腫脹而閉合；所用針頭尺寸也可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究使用具有隔離微環(huán)境的封閉室 TEWL 測(cè)量儀器（AquaFlux經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀）探測(cè)體外全層豬皮膚樣本的屏障功能，該方法靈敏度足以檢測(cè)到穿刺對(duì)皮膚屏障功能的降低作用，但觀察到的非線性模式需進(jìn)一步研究以明確其機(jī)制。